WesternBlot实验的是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将蛋白质样品按分子量大小分离，将分离的蛋白质转移到固相膜（如NC膜或PVDF膜）上。转移后的蛋白质在膜上以非共价键形式固定，保持其生物学活性并通过与特异性抗体的结合，以达到检测目的蛋白的技术。
WB实验涉及步骤繁杂、周期偏长，各环节操作均与最终结果紧密相关，极易因细节疏漏引发问题，所以要避开实操中的“雷区”。
瀚江生物整理了6个最常见的失败案例，每个案例都帮你找清原因、给出解决办法。
案例1：完全没有条带，目标蛋白“消失不见”
1. 可能原因：
①样品制备失败，蛋白降解或未提取出来；
②上样量不足；
③一抗浓度过高、失效（如反复冻融、保存不当）或一抗与目标蛋白不匹配；
④转膜不充分，蛋白没转移到膜上；
⑤显色底物失效；
⑥封闭不完全。
2. 解决方案：
①重新制备样品，全程加抑制剂，低温操作；
②增加上样量（可根据定量结果调整）；
③检查一抗保质期和稀释比例，用阳性对照验证一抗有效性；
④延长转膜时间（大分子蛋白）或提高转膜电流，转膜后用丽春红染色验证；
⑤更换新的显色底物，按说明书要求操作；
⑥加长封闭时间或更换封闭液。
案例2：条带模糊不清，像“蒙了一层雾”
1. 可能原因：
①凝胶浓度不合适，蛋白分离不彻底；
②上样量过多，蛋白过载；
③一抗浓度过高，非特异性结合增加；
④洗膜不充分，残留抗体导致背景干扰；
⑤转膜时蛋白扩散。
2. 解决方案：
①根据目标蛋白分子量调整凝胶浓度；
②减少上样量，保证条带清晰不重叠；
③降低一抗浓度，延长孵育时间（如4℃孵育过夜）；
④增加洗膜次数（每次5-10分钟，共3-5次），确保残留抗体洗净；
⑤转膜时保持低温，缩短转膜时间（避免过度转膜）。
案例3：出现黑色杂斑
1. 可能原因：
①封闭液溶解不完全或存放时间过长，结块残留在膜；
②一抗二抗产生非特异性结合；
③样本表达过低，曝光时间长。
2. 解决方案：
①可过滤封闭液或更换封闭液；
②更换一抗或优化抗体浓度与孵育条件、匹配二抗种属亚型减少二抗孵育时间、强化封闭洗涤流程；
③提高上样量、优化抗体孵育条件增强信号。
案例4：条带出现拖尾，像“彗星”一样
1. 可能原因：
①样品中盐浓度过高，影响电泳效果；
②蛋白发生聚合或降解；
③上样孔有残留样品，导致蛋白扩散；
④凝胶凝固不均匀。
2. 解决方案：
①对样品进行脱盐处理，或减少上样体积；
②重新制备样品，加入新鲜的抑制剂，避免反复冻融；
③上样前清理上样孔，确保样品完全进入凝胶；
④配制凝胶时充分混匀，避免气泡，确保凝固均匀。
案例5：条带两侧深中间浅
1. 可能原因：
①电泳槽缓冲液液面未完全没过凝胶、电泳时电压过高、电极丝与凝胶接触不均导致边缘泳道的电场强度高于中间泳道；
②配胶时搅拌不均APS/TEMED 加入后未及时混匀、凝胶在室温聚合时边缘先凝固；
③抗体孵育液面未能覆盖膜的正反面；
④三明治结构（海绵-滤纸-凝胶-膜-滤纸-海绵）边缘的压力大于中间，导致边缘蛋白转膜效率更高，条带更深。
2. 决方案：
①保证缓冲液液面高于凝胶至少1cm；降低电泳电压，检查电极丝是否清洁且与凝胶边缘平行接触；
②配胶时轻柔上下颠倒混匀，避免剧烈搅拌产生气泡，APS和TEMED 现配现用，加入后快速混匀并灌胶；
③确保孵育时抗体液完全覆盖膜的正反面，且液面高度超过膜边缘 1-2cm；
④在三明治结构中可减少一侧的海绵，防止边缘的压力大于中间影响转膜。
案例6：条带出现双带或多带
1. 可能原因：
①一抗特异性差，与样品中其他蛋白交叉反应；
②目标蛋白存在不同的剪切体或异构体；
③样品中存在蛋白二聚体或多聚体；
④一抗浓度过高。
2. 解决方案：
①更换特异性更高的一抗，或用阳性对照验证；
②查阅文献，确认目标蛋白是否存在剪切体/异构体；
③样品制备时加入还原剂（如β-巯基乙醇、DTT），破坏二硫键，避免蛋白聚合；
④降低一抗浓度，优化孵育条件。
WB实验小技巧，提升成功率！
1. 做好对照：每次实验设置阳性对照（已知含目标蛋白的样品）和阴性对照（不含目标蛋白的样品），方便判断实验结果的可靠性。
2. 标记清晰：凝胶、膜的正反面要做好标记，避免转膜、孵育时方向出错。
3. 试剂保存：一抗、二抗、显色底物等关键试剂需按要求低温保存，避免反复冻融，影响活性。
4. 耐心洗膜：洗膜是减少背景的关键，不要图快，确保每次洗膜充分。
