一、什么是 Western Blot 凝胶（PAGE）？
Western blot 凝胶是通过丙烯酰胺单体与交联剂（通常为双丙烯酰胺，bis-acrylamide）聚合形成多孔结构。蛋白质在电场中按分子量迁移，实现高分辨率分离。
与琼脂糖凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶孔径更小、分辨率更高，适用于 SDS-PAGE 和 Native PAGE，并可使用梯度或特殊配方。
自制凝胶的优势在于可以灵活控制以下几个方面：
1. 凝胶浓度和孔径大小
2. 凝胶厚度和板型
3. 梯度或特殊凝胶配方
二、凝胶结构组成
Western blot 常用凝胶为“两层结构”：
分离胶（Resolving Gel）
· pH 8.8
· 丙烯酰胺浓度较高
· 负责按分子量分离蛋白
浓缩胶（Stacking Gel）
· pH 6.8
· 丙烯酰胺浓度较低（通常 4–5%）
· 作用是将样品压缩成窄条带，提高分辨率
浓缩胶的存在，是条带“又细又直”的关键。
三、常用凝胶制作方法
1. 标准垂直凝胶（SDS-PAGE）
这是蛋白分析最常用的方法。基本流程如下：
· 配制分离胶（Resolving Gel）和浓缩胶（Stacking Gel）
· 组装凝胶板和间隔片
· 倒入分离胶，待略微凝固后倒入浓缩胶
· 插入梳子形成样品孔
· 浓缩胶可以将蛋白浓缩成锐利条带，从而提高分辨率。
推荐仪器：Hoefer 垂直电泳装置
2. 梯度凝胶（Gradient Gel）
梯度凝胶丙烯酰胺浓度逐渐变化，可同时分离低分子量和高分子量蛋白。
优点：
1. 蛋白大小跨度大时分辨率更高
2. 避免多次跑不同浓度凝胶
注意事项：
· 需要梯度混合器或泵
· 流速和时间必须保持均匀
· 聚合需均匀，避免局部过快或过慢
应用：蛋白组学、复杂样品分析
推荐仪器：Hoefer 梯度混合器
3. 非变性 PAGE（Native PAGE）
非变性PAGE保留蛋白天然结构和活性，不使用 SDS 或还原剂。适用于研究蛋白复合物、酶活性或构象变化。
特点：
· 由丙烯酰胺（acrylamide）和交联剂（bis-acrylamide）聚合而成
· 不含 SDS 或还原剂
· 缓冲体系需保持蛋白天然结构和活性
· 聚合条件与 SDS-PAGE 类似，但操作更敏感
四、凝胶浓度选择
选择合适丙烯酰胺浓度是分离效率的关键。一般参考如下表：
|
蛋白分子量 (kDa) |
推荐凝胶浓度 (%) |
|
<10 |
15–20 |
|
10–30 |
12–15 |
|
30–70 |
8–12 |
|
>70 |
6–8 |
高浓度凝胶 → 小孔径 → 小蛋白分辨率高
低浓度凝胶 → 大孔径 → 大蛋白迁移顺畅
五、不同浓度分离胶与浓缩胶配方（以 10 mL 为例）
A: 分离胶 (10 ml)
|
组分 |
8% |
10% |
12% |
15% |
|
ddH₂O |
4.63 ml |
4.0 ml |
3.3 ml |
2.3 ml |
|
30% Acr-Bis (29:1) |
2.67 ml |
3.3 ml |
4.0 ml |
5.0 ml |
|
1.5M Tris-HCl (pH 8.8) |
2.5 ml |
2.5 ml |
2.5 ml |
2.5 ml |
|
10% SDS |
100 µl |
100 µl |
100 µl |
100 µl |
|
10% APS |
100 µl |
100 µl |
100 µl |
100 µl |
|
TEMED |
6 µl |
4 µl |
4 µl |
3 µl |
B: 浓缩胶 (5 ml)
|
组分 |
体积 |
|
ddH₂O |
3 ml |
|
30% Acr-Bis (29:1) |
0.67 ml |
|
1.0M Tris-HCl (pH 6.8) |
1.25 ml |
|
10% SDS |
50 µl |
|
10% APS |
50 µl l |
|
TEMED |
5 µl |
注意：APS 必须现配现用，TEMED 最后加入。
